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技術文章
更新時間：2026-09-11
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近日，《Nature communications》發(fā)表了一項關于結核分枝桿菌DNA修復機制的重要研究，揭示了DNA誘導的Ku蛋白寡聚化是細菌非同源末端連接（Non-homologous end joining, NHEJ）修復的核心機制。在這項工作中，研究團隊借助FIDA（層流誘導分散分析）技術，在近生理溶液環(huán)境中完整解析了Ku-Mtb蛋白結合DNA進而發(fā)生寡聚化組裝的全過程，為闡明細菌NHEJ的分子機制提供了重要的實驗證據。
DNA雙鏈斷裂修復是細菌維持基因組穩(wěn)定的關鍵過程。結核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis, Mtb）依靠Ku蛋白介導的非同源末端連接（NHEJ）完成DNA損傷修復。然而Ku蛋白如何介導 DNA 突觸組裝（synapsis）并在非同源末端連接的DNA修復通路中怎樣發(fā)揮功能尚未得到解析。本研究借助包含F(xiàn)IDA在內的多種生物物理學技術，結合結構-功能-動力學多維分析，得到核心結論：
(1) Ku-Mtb蛋白寡聚化由DNA驅動并形成絲狀寡聚復合物。
(2) Ku-Mtb蛋白的絲狀寡聚體組裝是細菌非同源末端連接過程中引發(fā)DNA突觸組裝的核心。
(3) 抑制Ku蛋白寡聚化能夠阻斷DNA修復，進而削弱細菌在宿主體內脅迫環(huán)境中的生存能力。
本研究的關鍵環(huán)節(jié)——DNA結合誘導Ku蛋白發(fā)生寡聚化組裝——正是通過FIDA技術實現(xiàn)的。研究人員采用FAM熒光標記DNA在溶液環(huán)境下實現(xiàn)了：
(1) 精確表征蛋白寡聚：FIDA通過測定蛋白-DNA復合物流體力學半徑隨蛋白濃度梯度升高而發(fā)生的變化，完整表征了DNA結合驅動的Ku蛋白寡聚化全過程。
(2) 直觀且完整的數據展示：FIDA技術能夠明確區(qū)分Ku蛋白-DNA的兩步結合并表征二次結合過程中發(fā)生的高階寡聚，并提供Rh與親和常數雙重定量數據。
(3) 維持蛋白天然活性：液相環(huán)境保留蛋白自然生理構象，還原真實分子互作行為。
(4) 交叉驗證DNA誘導Ku蛋白發(fā)生寡聚化：FIDA技術測定的復合物粒徑變化與質量光度法（Mass photometry）測定的復合物分子量變化在兩個不同維度雙重驗證Ku蛋白寡聚化發(fā)生機制，數據真實可靠。
隨著DNA溶液中加入Ku-Mtb蛋白濃度的升高，Ku-DNA復合物Rh先下降后急劇升高，對應Ku-DNA結合的兩步反應：Ku-Mtb與DNA首先發(fā)生高親和力結合（表觀Kd納摩爾級別），引發(fā)蛋白質構象壓縮，造成Rh下降（綠色曲線）；隨后，已形成的Ku-DNA基礎復合物發(fā)生低親和力寡聚組裝（表觀Kd處于微摩爾級別），復合物Rh持續(xù)增大（紫色曲線）代表蛋白絲狀復合物不斷延伸（原文附圖8）。
附圖8：左：質量光度法分析中的分子量-對比度校準曲線。右：Ku-Mtb蛋白與DNA結合所形成復合物的流體力學半徑變化。
為了進一步研究該寡聚化過程，研究人員提升了溶液體系中Ku-Mtb濃度并采集了更多數據。隨著Ku濃度增加，復合物Rh持續(xù)上升。值得注意的是，在Ku濃度逐步升高過程中，復合物Rh出現(xiàn)若干特征平臺，這些平臺對應的分子粒徑與 Ku?Mtb?DNA 復合物的理論預測尺寸一一匹配。繼續(xù)提高Ku蛋白濃度，Rh進一步增大，說明Ku的寡聚化組裝動態(tài)過程還在持續(xù)（原文圖3）。
圖3A: Ku-DNA結合的質量光譜檢測。隨著Ku:DNA比例的升高，可觀測到分子量逐步增大的Ku-DNA復合物峰，圖上方對應復合物結構模型。
圖3B：FIDA實驗展示DNA存在時復合物流體力學半徑隨Ku蛋白濃度升高的變化。因該反應不屬于 1:1 結合模式，圖中未做擬合曲線；各個Rh平臺期分別對應冷凍電鏡所觀測到的不同復合物結構。
本研究之所以能明確解析DNA驅動的Ku蛋白寡聚化機制，正是因為FIDA技術具有以下獨特優(yōu)勢：
(1) 免固定或修飾：在溶液中直接分析天然狀態(tài)下的蛋白-DNA互作與蛋白寡聚。
(2) 高分辨率寡聚分析：可分辨多步結合與高階寡聚，定量展現(xiàn)粒徑變化與親和常數。
(3) 微量樣本、高通量：適合結構生物學珍貴樣品與多濃度梯度實驗。
(4) 動態(tài)復雜體系兼容：可完整表征多組分動態(tài)寡聚的生物組裝全過程。
該研究不僅解析了結核分枝桿菌非同源末端連接（NHEJ）通路中DNA驅動Ku蛋白寡聚化組裝的分子機制，提出了靶向抑制Ku寡聚的抗結核病新藥策略，更展示了FIDA技術在復雜生物分子互作研究中的能力。
未來，F(xiàn)IDA技術可廣泛應用于：
• 新藥物靶點的開發(fā)
• 蛋白-蛋白、蛋白-小分子互作定量
• 復合物組裝與解離動力學研究
• 抗體—抗原、受體—配體互作表征
隨著FIDA等技術在動態(tài)互作研究中的深入應用，將會有更多生命活動的“調控密碼"被一一破解。
什么是FIDA？FIDA可在溶液體系中測定結合親和力，無需固定化處理，也不存在表面相關偽影。對于從頭設計的結合分子，這意味著可以直接在未純化或經過熱處理的裂解液中測定解離常數Kd；檢測采用96孔板形式，所需體積為納升至微升級別。因此，設計產物可從表達階段直接得到親和力排序結果，中間無需純化步驟。每次檢測還可輸出流體力學半徑，在同一輪實驗中即可提示聚集或自締合現(xiàn)象。
* 相關文獻：Zahid et al., Oligomerisation of Ku from Mycobacterium tuberculosis promotes DNA synapsis. Nature communications (2025). DOI: 10.1038/s41467-025-65609-y
* 本文轉載自「FIDA分子互作」微信公眾號
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